二硝托胺因其毒性小，防治球蟲效果好而得到普遍應(yīng)用，但長期高濃度使用會造成藥物殘留，對人體健康造 成 潛 在 危 害我 國 農(nóng) 業(yè) 部235號公告中規(guī)定二硝托胺的zui大殘留*以親體和代謝產(chǎn)物(3-Amino-5-nitro-o-toluamide，ANOT)總量計，雞肉和雞肝中分別為3000和6000!g/kg目前尚缺乏相應(yīng)的殘留分析物標(biāo)準(zhǔn)方法，因此有必要開展測定雞組織中二硝托胺和ANOT殘留量的分析方法研究。
實驗部分
2．1儀器與試劑
Waters超液 相 色 譜 儀(美 國Waters公 司) ，配二極管陣列檢測器;AcquityBHEC18色 譜 柱(100mm×2．1mm，1．7!m) ;固相萃取儀(美國Supelco公司) ;HLB小柱(3mL，60mg，Waters公司) ;Sigma離心機(jī);Ultra-TyrraxT25型勻質(zhì)器(德國)。
二硝托胺和ANOT標(biāo)準(zhǔn)品(Dr．Ehrenstorfer公司) ;甲醇和乙腈(色譜純，Merck公司) ;甲酸(色譜純，Tedia公司) ;KH2PO4和K2HPO4·3HO2(分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司) ;磷酸鹽緩沖液(pH6．0和4．0)。
2．2色譜分離條件
流動相:A為0．1%甲酸，B為乙腈。梯度洗脫:0～1．0min，80%A;1．0～4．0min，80%～30%A;4．0～5．0min，30%A;5．0～5．1min，30%～80%A;5．1～7．0min，80%A。流速0．2mL/min，進(jìn)樣量10!L，檢測波長317nm;柱溫30°C。
2．3樣品處理
準(zhǔn)確稱取2g試料于50mL離心管中，在雞肉和雞肝中分別加入pH7．0和pH4．0的磷酸鹽緩沖液10mL，以10000r/min速度勻質(zhì)1min，再以8000r/min離心5min，收集上清液;在殘渣中再加入10mL磷酸鹽緩沖液，同樣步驟操作后合并上清液;取4mL上清液調(diào)至pH7．0，再以8000r/min離心5min，上清液加入到已經(jīng)被3mL甲醇和3mL水活化的HLB小柱中，待凈化液液面到達(dá)柱吸附層表面時加入3mL水淋洗，抽干柱子，用4mL0．1%甲酸-乙腈(80∶20，V/V)洗脫，收集洗脫液，過0．22!m濾膜，供LC分析。
3結(jié)果與討論
3．1色譜條件的建立
在210～800nm范圍內(nèi)對二硝托胺和ANOT的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描(圖1) ，二硝托胺存在兩個zui大圖1二硝托胺(a)和ANOT(b)光譜分別在216．0和300．8nm;而ANOT至少存在兩個zui大吸收峰，分別為317．4和526．9nm?？紤]到ANOT的靈敏度低于二硝托胺，為盡量提高ANOT的靈敏度，避免干擾峰，本實驗選擇317nm進(jìn)行分析。
采用梯度洗脫對二硝托胺和ANOT進(jìn)行同時分析時，初始流動相中有機(jī)相比例大于25%時，ANOT和二硝托胺出峰太快，易受雜質(zhì)干擾;而有機(jī)相比例低于15%時，ANOT由于出峰較遲而易受雜質(zhì)干擾。本實驗將初始流動相中水相和有機(jī)相的比例定為8∶2。從圖2可 知，二硝 托 胺 和ANOT的 峰 形 均 較好，在空白組織中未見干擾。
3．2提取和凈化條件的選擇
二硝托胺和ANOT極性較強(qiáng)，且易溶于酸性溶液，本實驗采用磷酸鹽緩沖液pH(4，5，6和7)提取雞肌肉和雞肝樣品(圖3)。當(dāng)pH=6．0時，肌肉樣品中二硝托胺和ANOT的提取回收率均高于90%;于肝臟樣品，pH=4．0～7．0時，提取效果越來越差，僅pH4．0時，二硝托胺和ANOT的提取回收率高于90%。因此，提取樣品時，肌肉和肝臟樣品分別采用pH6．0和pH4．0的磷酸鹽緩沖液。
而對實驗發(fā)現(xiàn)，雞肉提取液直接進(jìn)行固相萃取凈化時，ANOT的回收率僅約40%，且HLB小柱換成BondElutC18小柱后，回收率無明顯改善。而雞肉提取液調(diào)至pH7．0后進(jìn)行實驗，過HLB小柱，回收率大于90%;過BondElutC18柱，回收率無明顯改善。本實驗采用HLB小柱進(jìn)行凈化。
3．3線性實驗
稱取二硝托胺和ANOT標(biāo)準(zhǔn)品各10．0mg于100mL容量瓶中，用乙腈定容，得100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用0．1%甲酸-乙腈(80∶20，V/V)稀釋，配制20，100，200，500，1000和2000!g/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行LC分析，每個濃度進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實驗結(jié)果表明，二硝托胺和ANOT的線性范圍為20～2000!g/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=206．6x－1049．7(ANOT)和y=211．5x－1787．8(二硝托胺) ，相關(guān)系數(shù)(r)均高于0．9998。本方法適用于二硝托胺和ANOT的定量分析。
3．4方法的檢出限、回收率和精密度
采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對雞肉和雞肝樣品進(jìn)行了3次添加回收實驗，每個濃度點重復(fù)進(jìn) 行6次，結(jié) 果 見 表1。雞肉和雞肝中各濃度點二硝托胺和ANOT的平均添加回收率均在79．2%～88．1%之間。批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在2．7%～5．2%之間，批間RSD均在4．1%～6．9%之間，方法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。同時按信噪比S/N=3∶1計算得兩種組織中的檢出限為55．0!g/kg(ANOT)和25．0!g/kg(二硝托胺)。
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