雙 氰 胺（ｄｉｃｙａｎｄｉａｍｉｄｅ，ＤＣＤ）又 稱(chēng) 二 氰 二 胺，分子式 為Ｃ２Ｎ４Ｈ４。雙 氰 胺 是 一 種 白色 結(jié) 晶 粉 末，可溶于水，是一種重要的有機(jī)化工原料，可用于生產(chǎn)三 聚 氰 胺，在 醫(yī) 藥 工 業(yè) 中 也 可 以 用 于 制 取硝 酸 胍和 磺 胺 類(lèi) 藥 物，還 可 以 用 于 固 色 劑、黏 合 劑 等，農(nóng)業(yè)上用于對(duì)肥料的凝固作用，防止肥料流失，對(duì)肥料中的硝酸鹽類(lèi)（如硝酸鉀）、胺類(lèi)化合物進(jìn)行中和，減少該類(lèi)化學(xué)物質(zhì)的有害作用。雙氰胺對(duì)人 體 是否有害以及含量多少會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害目前尚沒(méi)有明確的研究結(jié) 論，還需要進(jìn)行毒理研究。但 雙 氰 胺是含氮量高且性 質(zhì) 較 穩(wěn) 定 的 非 蛋 白 氮 物質(zhì)，少 量 加入不影響食品風(fēng) 味；由 于 目 前 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 規(guī) 定 的 蛋 白質(zhì)測(cè)定方法基于 凱 氏 定 氮 法，樣品中任何含氮物質(zhì)均折算成蛋白質(zhì)含量，因此很可能被不法商家利用，非法添加到食品中。
本文建立了乳制品中雙氰胺的液相色譜－紫外檢測(cè)法，優(yōu)化 了 前 處 理 方 法 和 高 效液 相 色 譜 條 件。該 方法 簡(jiǎn) 便、快 速、有 效，適 用 于 乳制品中雙氰胺的檢測(cè)。
一、實(shí)驗(yàn)部分
１．１儀器、設(shè)備和試劑
Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０高 效 液 相 色 譜 儀（配 二 極 管 陣 列檢測(cè)器）；乙 腈、甲 酸（色 譜 純，Ｍｅｒｃｋ公司）；試 驗(yàn) 用水為Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超 純 水。標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì)：雙 氰 胺（純 度９９．４％，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司）。
雙 氰 胺 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 的 配 制：準(zhǔn) 確 稱(chēng) 取１００ｍｇ雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于１００ｍＬ容量 瓶 中，用 水 溶 解，配 制 成１．０ｇ／Ｌ的儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相 將 標(biāo) 準(zhǔn) 儲(chǔ) 備 液 稀 釋 成０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０、２０．０、５０．０ｍｇ／Ｌ的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
１．２色譜條件
液相色譜 柱：ＸＢｒｉｄｇｅＡｍｉｄｅ柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，３．５μｍ，Ｗａｔｅｒｓ公 司）；柱 溫：３５°C；進(jìn) 樣 量：２０μＬ；流動(dòng)相：乙 腈－水（體 積 比 為９０∶１０）（含 體 積分?jǐn)?shù)為０．２％的 甲 酸）；流 速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；檢 測(cè) 波長(zhǎng)：２１８ｎｍ。
１．３樣品前處理
稱(chēng)取固態(tài)、半固態(tài)樣品（奶粉、煉 乳 等）１ｇ（精 確到０．０１ｇ）或 液 態(tài) 樣 品（純 奶、酸 奶 等）２ｇ（精 確到０．０１ｇ），置于１０．０ｍＬ比色管中，固態(tài)、半固態(tài)樣品加入３ｍＬ７０°C熱水，液態(tài)樣品加 入１ｍＬ７０°C熱水 充分渦旋２ｍｉｎ，置于７０°C熱水浴中１５ｍｉｎ充分溶解提取，冷卻至 室 溫，渦 旋 中 分３次 加 入 乙 腈，每次加入２ｍＬ，zui后用乙腈定容至１０．０ｍＬ，渦 旋 搖勻，?。玻恚桃后w至２ｍＬ離 心 管 中，以８０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，?。保埃恚躺?清 液 于５０°C下 氮 氣 吹干，用１．０ｍＬ流 動(dòng) 相 溶 解，過(guò)０．４５μｍ濾 膜，濾 液供ＨＰＬＣ分析。
二、安捷倫液相色譜儀1260結(jié)果與討論
２．１色譜條件的優(yōu)化對(duì)雙氰 胺 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 進(jìn) 行 光 譜 掃 描，發(fā) 現(xiàn) 在２１８ｎｍ處有zui大吸收，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為２１８ｎｍ。
雙 氰 胺 在Ｃ１８柱 上 幾 乎 無(wú) 保 留。雙 氰 胺 的 性質(zhì)和三聚氰胺類(lèi) 似，因 此 試 圖 采 用 與 三 聚 氰 胺 檢測(cè)相同的多種離子對(duì)試劑如庚烷磺酸鈉等作為流動(dòng)相，但是沒(méi)有達(dá) 到 預(yù) 期 效 果?；陔p氰胺的性質(zhì)，采 用 了ＸＢｒｉｄｇｅＡｍｉｄｅ柱 作 為 分 離 柱。選 擇 不同比例的乙腈－水作為流動(dòng)相，對(duì) 雙 氰 胺 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有出現(xiàn)目標(biāo)物色譜峰，加入少量甲酸后，得到相應(yīng)的目標(biāo)物色譜峰。通過(guò)實(shí)驗(yàn)zui終確定以含０．２％甲酸的乙腈－水（９０／１０，ｖ／ｖ）作 為 流 動(dòng) 相 時(shí)，目標(biāo)峰的峰形和保 留 時(shí) 間 zui 佳，并且目標(biāo)峰的保留時(shí)間為５ｍｉｎ左 右，大大減少了基質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰的干擾作用，優(yōu)化條件下的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖１。
２．２安捷倫液相色譜儀1260前處理方法的建立
乳制品基質(zhì) 比 較 復(fù) 雜，對(duì)檢測(cè)的主要干擾物為脂肪和蛋白質(zhì)，因 此 除 去 脂 肪 和 蛋 白 質(zhì) 的 干 擾 zui 為關(guān)鍵。綜合考慮 采 用 有 機(jī) 試 劑 沉 淀 蛋 白 質(zhì)，便 于 后續(xù)樣品的處理。
直接用乙腈 進(jìn) 行 定 容 后 渦 旋 超 聲 提 取，發(fā) 現(xiàn) 回收效果不穩(wěn)定，回收率差異較大，且乳制品中的蛋白質(zhì)往往黏結(jié)成 塊狀。推 測(cè) 在 乙 腈 快 速 加 入 后，蛋 白質(zhì)迅速黏結(jié)包夾了部分雙氰胺?？疾炝司徛尤胍译鎸?duì)蛋白質(zhì)沉淀和回收率的影響。結(jié) 果 表 明，在 渦旋條件下，緩慢加 入 乙 腈 能 有 效 地 防 止 蛋 白 質(zhì) 迅 速黏結(jié)，蛋白質(zhì)呈分散狀態(tài)，回收率高且穩(wěn)定。另外還考察了超聲提取對(duì)回收率的影響，結(jié)果表明，在渦旋過(guò)程中緩慢加入乙腈后超聲與否不影響提取效果。故本文采用在渦旋過(guò)程中緩慢加入乙腈的提取方式。
實(shí)驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn) 將 上 述 提 取 液 過(guò) 微 孔 濾 膜 后 直 接 進(jìn)樣，樣色 譜 圖 會(huì) 有 很 高 的 溶 劑 峰。取１．０ｍＬ提取液于５０°C下 氮 氣 吹干，再 用１．０ｍＬ流 動(dòng) 相 溶解，過(guò)濾膜，濾液供ＨＰＬＣ分 析，則 樣 品 色 譜 圖 中 的溶劑峰消失，因此，樣品提 取 后 取１．０ｍＬ提 取 液 用氮?dú)獯蹈?，再用流?dòng)相重新溶解樣品，供色譜檢測(cè)。
２．３安捷倫液相色譜儀1260線性范圍、檢出限和定量限
對(duì)雙氰胺的 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 進(jìn) 行 檢 測(cè)，以 儀 器 響 應(yīng) 的峰面積Ｙ對(duì)雙氰胺的質(zhì)量濃度Ｘ進(jìn)行線性回 歸，雙氰胺在０．５～５０ｍｇ／Ｌ范 圍 內(nèi) 的 線 性 關(guān) 系 良 好，回歸方程 為Ｙ＝１５３．８７Ｘ＋２１．５６，相 關(guān) 系 數(shù)（ｒ２）為０．９９９９。在空白樣品處理液 中 添 加 雙 氰 胺 標(biāo) 準(zhǔn) 品，以Ｓ／Ｎ＝３確定方法的檢出限，以Ｓ／Ｎ＝１０確 定 方法的定量限，得到雙氰胺的檢出限為０．２ｍｇ／ｋｇ，定量限為０．５ｍｇ／ｋｇ。
２．４回收率和精密度
對(duì)乳粉（經(jīng)確認(rèn)不含雙氰胺）樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，添加水平分別為１．０、２．０和５．０ｍｇ／ｋｇ，采 用 優(yōu)化后的前處理方 法 對(duì) 樣 品 進(jìn) 行 處 理，每 個(gè) 添 加 水 平重復(fù)６次，平 均 回 收 率 分 別 為１０１．０％、９６．７％和９９．７％，ＲＳＤ分別為４．８％、４．５％和４．９％（見(jiàn)表１）。
２．５實(shí)際樣品測(cè)定
采用本方法對(duì)鮮奶、酸奶、煉乳、乳粉等４０批乳制品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均未檢出雙氰胺。
三、安捷倫液相色譜儀1260結(jié)論
利用液相色譜法對(duì)乳制品中的雙氰 胺 進(jìn) 行分 析，該方法優(yōu)化了ＸＢｒｉｄｇｅＡｍｉｄｅ柱的分析條件，色譜峰保留 時(shí) 間 優(yōu) 化 為５ｍｉｎ左 右，大 大 降 低 了 基質(zhì)的干擾，方法簡(jiǎn) 單 快 速，準(zhǔn) 確 度 和 精 密 度 高，適 用于各種乳制品中雙氰胺的檢測(cè)。采用乙腈作為沉淀劑能有效地沉淀蛋白質(zhì)，消除蛋白質(zhì)干擾，從而保障了該方法對(duì)乳制品中雙氰胺分析的準(zhǔn)確性。本方法適用于乳制品中雙氰胺的分析和質(zhì)量控制。
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